Задачи хромосомного анализа

Как известно, все, что человек наследует от своих родителей, заключено в двух клетках: в женской половой клетке - яйцеклетке и в мужской половой клетке - сперматозоиде. Носителями наследственной информации являются не все составные части родительских половых клеток, а только их ядра - ядро сперматозоида и ядро яйцеклетки.

Именно клеточные ядра содержат те структуры, в которых заключена наследственная информация - хромосомы. В них содержатся материальные носители наследственной информации - гены. Хромосома содержит сотни и даже тысяче генов. От них зависит, к какой группе принадлежит кровь человека, какой у него цвет глаз и рисунок ладони; как хорошо он различает цвета спектра и т. д., т. е. гены определяют тысячи признаков, которые все вместе составляют физическую и психическую сущность организма.

Число хромосом в клетках различных видов животных или растений бывает самое различное. Например, у одного вида круглых червей (лошадиных-аскарид) обнаружены всего две хромосомы, тогда как в клетках некоторых ракообразных содержится до 200 хромосом. Встречаются виды животных и растений, имеющие одинаковое число хромосом, но сами хромосомы при этом отличаются но форме. Для каждого вида организмов характерен определенный, строго постоянный - как но числу, так и по содержанию генетической информации - набор хромосом.

Рис. 3. Метафазная пластинка (а) и разложенные по группам хромосомы (б) (В. М. Гиндилис, 1967)

Идентификация наборов хромосом основывается на понятии кариотипа. Кариотип представляет любой совокупность количественных и качественных характеристик хромосомного набора, таких, как число, размеры и форма хромосом. На рис. 3,а приведена микрофотография набора хромосом из лейкоцитов человека. Xpoмocoмы сфотографированы в период деления клетки (на стадии метафазы) и образуют так называемую метафазную пластинку. Каждая хромосома состоит из двух расположенных параллельно хроматид, соединенных в центромерном участке^*. Отрезки хроматид по обе стороны от центромеры называются плечами хромосомы. В зависимости от расположения центромеры различают несколько типов хромосом: метацентричные - с плечами неравной или почти равной длины; субметацентричные - с плечами неравной длины и акроцентричные - с одним очень коротким плечом.

^* (Центрометра - участок хромосомы, ответственный за ее перемещение в период деления клетки.)

Нормальный хромосомный набор человека содержит 46 хромосом. Они образуют 23 пары, в каждой из которых одна храмосома получена от отца, другая - от матери. Среди 23 пар хромосом выделяют одну пару, ответственную за развитие пола человека - половые хромосомы. Они обозначаются как X-хромосома и Y-хромосома. Женщины имеют две одинаковые X-хромосомы, а мужчины - одну X-хромосому и одну Y-хромосому.

Хромосомы каждой пары содержат гены, ответственные за одними те же признаки. Такие хромосомы называются гомологичными. Генетическое соответствие гомологичных хромосом объясняет их геометрическое сходство. Однако это еще не означает, что негомологичные хромосомы должны обязательно отличаться но форме и размерам. Наоборот, у многих видов организмов значительная часть хромосом имеет сходную геометрию, Хотя хромосомный набор человека разделяется на 23 пары гомологичных хромосом, однако, практически на основе морфологии, по данным В. М. Гиндилиса (1967), хромосомы человека распределяются только на 9 достоверно различающихся между собой групп (рис. 3, б), В пределах этих групп провести классификацию отдельных пар гомологов на основе их геометрии не представляется возможным.

Схематическое изображение хромосом данного набора, в котором точно указали размеры хромосом и соотношения плеч, носит название идиограммы. Ее строят на основании измерении хромосом многих клеток для получения статистически достоверных результатов. Идиограмма, представленная на рис. 4, соответствует нормальному кариотипу человека.

Рис. 4. Идиограмма хромасомного набора человека (В. М. Гиндилис, 1967)

Большинство встречающихся нарушений кариотипа можно разбить на два класса: численные и структурные. В первом случае геометрия всех хромосом данного набора соответствует стандарту, но число хромосом меньше или больше стандартного. При структурных нарушениях имеется нормальное число хромосом, или точнее центромер, но возможны отклонения в геометрии отдельных элементов.

Заболевания человека, вызванные изменением числа и формы хромосом, носят название хромосомных болезней и составляют особый раздел медицинской генетики - медицинскую цитогенетику.

В настоящее время у человека описано уже несколько сотен заболеваний, обусловленных теми или иными нарушениями в кариотипе. Так, например, 25% всех спонтанных прерываний беременности; особенно на ранних сроках, обусловлены нарушениями кариотипа эмбриона, несовместимыми с его развитием. Среда ряда механизмов, приводящих к отклонению от нормы числа хромосом, можно указать, например, на оплодотворение одной яйцеклетки двумя сперматозоидами.

В среднем один на 600-800 новорожденных страдает болезнью Дауна, ведущим симптомом при которой является глубокое слабоумие, часто (сочетающееся с дефектами развития сердца и других органов. Кариотип больных включает дополнительную, 47-ю, хромосому, относящуюся по своей морфологии и генетической структуре к 21-й варе. Иными словами, при болезни Дауна и 21 -й паре имеется три гомологичных элемента^ откуда происходит точное кариологическое название болезни - трисомия по 21-й хромосоме.

При других трисомиях нарушения развития столь тяжелы, что жизнеспособность резко снижается и ребенок погибает еще во время рождения или на первом году жизни. Таковы трисомии по 18-й и 13-й хромосомам, встречающиеся примерно в одном случае на 4-10 тысяч новорожденных.

В случае нарушений в системе половых хромосом жизнеспособность часто почти не снижается, поэтому доля хромосомных заболеваний среди эндокринологических больных велика. При нарушениях в системе половых хромосом типичными симптомами являются: недоразвитие или неправильное развитие первичных и вторичных половых признаков, бесплодие. В качестве примера можно назвать болезнь Тернера-Шерешевского у женщин: отсутствие в кариотипе одной половой хромосомы - ТРШ 45, ХО; и болезнь Клайнфельтера у мужчин: наличие дополнительной половой хромосомы - тип 47, XXY.

При диагностике численных нарушений кариотипа исследователь нередко сталкивается с необходимостью детально анализировать большое число клеток. Дело в том, что в зависимости от стадии развития эмбриона, на которой происходит изменение числа хромосом, могут образоваться клеточные линии с различными типами численных нарушений кариотипа. Организмы, в которых при анализе обнаруживаются две и больше клеточных линий, различающихся своими кариотипами, называются хромосомными мозаиками, а само явление - мозаицизмом.

Так, упоминавшаяся болезнь Тернера-Шерешевского может встречаться в различных клинических вариантах в зависимости от степени нарушения кариотипа. Описаны, например, пациентки с кариотипами 45, XO/46, XX ли 45, ХО/46, XX/47 XXX и др. Формула первого случая означает, что у данной больной часть изученных клеток имела кариотип с недостающей половиной X-хромосомой, а часть - нормальный кариотип. Во втором случае речь идет уже о трех клеточных линиях: одна с нормальным кариотипом и две с различными нарушениями (моноеомия по X-хромосоме в одной линии и трисомия по X-хромосоме в другой).

Своеобразным типом мозаицизма при истинном гермафродизме является кариотипический вариант 46, ХХ/46, XY. Клинически у таких пациентов часто находят функционирующие половые железы мужского и женского пола, что легко объяснимо, поскольку одна клеточная линия содержит нормальный мужской кариотип 46, XY, а другая линия - нормальный женский 46, XX. Их совместное сосуществование в одном организме приводит к нарушению развития половых органов. У разных больных количественное соотношение клеточных линий может различаться. В связи с этим подсчет числа хромосом и даже детальный анализ в небольшом: числе клеток могут привести к ошибочному диагнозу. Так, в случае мозаицизма только что упомянутого типа при. соотношении 80% 46, XX и 20% 46, XY при исследовании первых 25-30 клеток совсем нередко может быть так, что ни один из мужских наборов не попадет в выборку. В таком случае может быть сделан ошибочный вывод о наличии у пациента нормального женского кариотипа.

Структурные нарушения хромосом, имеющие клиническое значение, встречаются так же часто, как и численные. Примером может служить синдром^* так называемого "кошачьего крика". Несколько экзотическое название болезни обусловлено тем, что у большинства детей с этим синдромом уже при рождении выявляется характерный крик высокого тона, напоминающий мяуканье котенка. Кариологичееки у таких детей обнаруживают нехватку участка короткого плеча 5-й хромосомы.

^* (Синдром - сочетание признаков (симптомов), характерное, для какой-то болезни.)

Упомянем еще несколько примеров, иллюстрирующих специфические задачи, связанные с медико-генетической консультацией. Типичными поводами для такой консультации служат неоднократные спонтанные аборты, синдромы у детей с умственным недоразвитием, нарушения развития пола у детей старшего возраста и взрослых, первичное бесплодие и т. д. Основной вопрос, который интересует больных или их родителей, состоит в определении вероятности повторного появления аналогичных случаев в данной семье.

Специфика хромосомных заболеваний обусловливает необычный для медицинской практики характер обследования. Обычно врач изучает - состояние только самого пациента, обратившегося за помощью. В медико-генетической консультации обследование пациента является лишь частью работы. Помимо этого, большой объем клинических и лабораторных исследований проводится и для ближайших родственников больного. Так, болезнь Дауна, или трисомия по 21-й хромосоме, может встречаться в двух вариантах: явная трисомия, когда дополнительная 21-я хромосома присутствует в свободном виде, и неявная трисомия, когда та же лишняя хромосома присутствует в наборе, но сцеплена с другой хромосомой и в таком виде похожа на нормальную хромосому из другой группы.

Клиническая картина обоих вариантов совершенно одинакова, и .дифференцировать их обычными методами медицинского обследования невозможно. Между тем в случае явной трисомии вероятность повторного рождения ребенка с болезнью Дауна практически близка к нулевой, тогда как не неявной трисомии она равна 25%. Поэтому рекомендации родительской паре, у которой первый ребенок родился с болезнью Дауна, могут быть даны только после детального хромосомного анализа. В подобных случаях часто приходится проводить анализ кариотипов не только обоих родителей, но даже членов семьи, более ранних поколений и боковых ветвях, т. е. анализ лишь одной семьи превращается в самостоятельное, весьма трудоемкое исследование, на которое опытный исследователь может потратить несколько месяцев.

Приведенные случаи, разумеется, далеко не исчерпывают всего разнообразия хромосомных нарушений, имеющих клиническое значение. Однако они убедительно доказывают важность прикладных задач медицинской цитогенетики. Кроме того, существует ряд научных проблем, для решения которых также необходим анализ большого числа кариотипов.

Одной из частных, но достаточно интересных и перспективных задач современной кариологии является обнаружение возможных закономерностей взаимного расположения хромосом в клеточном ядре.

На первом этапе можно исследовать взаимное расположение хромосом в плоскости препарата на площади, занимаемой данной делящейся клеткой. Оценкой взаимного расположения могут служить расстояния между центромерами хромосом, нормированные относительно радиуса наименьшего из кругов, описанных вокруг хромосом одной клетки. Если учесть, что в каждой клетке необходимо измерить и пронормировать несколько десятков расстояний, а ряд других аспектов общей проблемы предполагает исследование разных тканей у разных индивидуумов, колоссальный объем предварительного сбора данных очевиден.

Из других задач экспериментальной кариологии, решение которых с помощью машинного анализа хромосом в принципе возможно уже в ближайшие годы, можно упомянуть проблему изучения специфичности повреждений хромосом под воздействием радиации, химических веществ и вирусов. В этой области проводятся как теоретические разработки, так и практические исследования. Например, для огромного числа промышленных химических веществ и лекарственных препаратов совершенно неизвестна их роль в развитии хромосомных нарушений. Хотя (генетическая аппробация этих веществ уже начата -некоторыми исследователями у нас в стране, объем необходимых исследований по этой проблеме очень велик. Без автоматического анализа хромосом трудно ожидать достаточно быстрого решения этой задачи во всех аспектах.

Не менее важными являются также исследования радиационных повреждений хромосом у лиц, так или иначе соприкасающихся с производственными радиационными установками, включая широко распространенные в медицине рентгеновские аппараты.

Можно стлать вывод, что большинство нарушений кариотипа; как численные, так и структурные, требуют для своего анализа длительной трудоемкой работы. При этом значительная часть времени уходит на построение и анализ кариотипа. Поэтому возникает задача автоматизации этих исследований. На первом этапе необходимо автоматизировать наиболее трудоемкий и вместе с тем наиболее легко поддающийся формализации процесс измерения и классификации. В настоящее время в Институте биологической физики АН "СССР разрабатываются системы машинного анализа хромосом. Подобные разработки ведутся также во многих зарубежных лабораториях.

Рис. 5. Морфометрия хромосомы; Ц - центромера

Прежде чем перейти к описанию машинного анализа хромосом остановимся на методике, используемой при обычных кариологических исследованиях. Для анализа хромосом построении кариотипа в настоящее время используются три группы методов: фотометрия, радиоавтография и морфометрия (анализ геометрии). При кариологических исследованиях получили наибольшее распространение морфометрические методы. Они позволяют определить геометрические параметры хромосом - прежде всего длину хромосомы и соотношение длин ее плечей. Обычно для этого используют микрофотографий хромосом, полученные при достаточно большом увеличении. Хромосомы вырезают и затем вдоль каждой хроматиды выполняют тонкой иглой проколы, центромерный прокол наносят в наиболее светлой точке центромерного района (рис. 5). Потом измеряют расстояния между проколами и, суммируя их, получают длины соответствующих плечей:

где l₁, l₂, l₃, l₄ - длины плечей; Δl_i - расстояние между протоколами; n, m, d, k - число проколов на соответствующих плечах. По результатам измерений определится средняя длина короткого плеча и средняя длина длинного плеча. На основе этих данных определяют два морфометрических параметра: относительную длину данной хромосомы в общей длине всего набора и так называемый центромерный индекс:

относительная длина хромосомы:

центромерный индекс:

где L^K_i - длина короткого плеча i - хромосомы; L^Д_i - длина длинного плеча той же хромосомы; L_Σ - общая длина данного хромосомного набора, приведенная к длине женского набора (суммируется длина двух X-хромосом, а длина Y-хромосомы не учитывается). Затем строит так называемую кариограмму, представляющую собой плоскость, где каждая хромосома изображается в виде точки. По оси абсцисс откладывается относительная длина хромосом, а по оси ординат - центромерный индекс. При наложении достаточно большого числа (20-50) кариограмм отдельных наборов получается поликариограмма, на которой имеются изолированные друг от друга скопления точек. Статистический анализ этих скоплений позволяет выделить достоверно различающиеся группы хромосомы. Результатом анализа является построение кариотипа (идиограммы) исследуемых"наборов.

Обычно хромосомы у'человека получают из лейкоцитов (клеток белой крови). Их помещают на питательную среду, где они растут до стадии деления. Клетки при этом развиваются неодновременно. В то же время хромосомы при делении претерпевают последовательно усиливающуюся спирализацию, приводящую к значительному уменьшению их длины и к их утолщению. Поскольку при фиксации материала для приготовления препаратов различные клетки захватываются на разных стадиях митотической спирализации, хромосомные наборы клеток из одного препарата часто характеризуются резкими различиями в длине и толщине хромосом. Например, длина первой хромосомы человека в клетках, вполне пригодных для анализа, может составлять от 14 до 4 мк.

Столь высокая вариация размера одной и той же хромосомы в разных клетках, естественно, затрудняет анализ. Кроме того, наблюдается еще различная спирализация хромосом в пределах одного набора. Эта спирализация носит систематический характер и связана с двумя основными закономерностями: во-первых, по мере спирализации более длинные хромосомы укорачиваются в большей степени, во-вторых, по мере укорочения длинное плечо каждой хромосомы сокращается сильнее. Таким образом, доля длины хромосомы в общей длине набора не остается постоянной, а изменяется в значительных пределах. Соответственно происходит и систематическое смещение центромерного индекса.

Очевидно, что явление спирализации хромосом необходимо учитывать как при "ручных" кариологических исследованиях (именно для уменьшении влияния спирализации при анализе используют не абсолютную длину хромосомы, а ее долю в общей длине набора), так и при автоматизации процесса кариотипирования.